Эксперименты
Планируемые и текущие эксперименты
Эксперимент №1: Только фактор Oct4 в человеческих клетках in vitro
Идея: Исследовать, может ли один Oct4 (без остальных факторов Яманаки) безопасно откатывать эпигенетический возраст человеческих клеток in vitro, при этом сохраняя их дифференциацию.

Обоснование: Несколько публикаций дают основания полагать, что Oct4 является главным ранним фактором репрограммирования и эпигенетического отката. Например, см. график справа.

Также следующие работы подтверждают гипотезу, что Oct4 является инициатором процесса эпигенетического отаката:


Ранее было показано, что факторы Яманаки (OSKM, где O обозначает Oct4) снижают эпигенетический возраст постепенно.

Например, в этом препринте это было продемонстрировано на человеческих фибробластах:
https://www.biorxiv.org/content/early/2018/03/31/292680

Открытие этого постепенного свойства эпигенетического репрограммирования позволяет нам смотреть с оптимизмом на то, что нам удастся найти безопасное терапевтическое окно (например, отмеченное желтой рамкой на графике справа) - то есть период безопасного эпигенетического отката, когда профиль метилирования клетки возвращен в более молодое состояние, но сама клетка ещё не потеряла своих функциональных характеристик (т.е. клетка кожи остается клеткой кожи, а не дедифференцируется в плюрипотентную клетку).
Мы считаем, что теперь мы можем использовать аналогичный экспериментальный дизайн для того, чтобы подтвердить, что Oct4 сам по себе может также откатить эпигенетические часы и сделать это более безопасно, чем OSKM. Мы также хотели бы найти оптимальный режим дозирования, который обеспечивает длительное эпигенетическое омоложение без риска дедифференцировки.

Нашу гипотезу подкрепляют не только упомянутые выше статьи, но и график (справа) из другого исследования, в котором показано, что Oct4 сам по себе снижает эпигенетический возраст человеческих фибробластов.

Мы планируем сконструировать вектор, несущий ген Oct4 под контролем Tet-On системы, а затем интегрировать его в человеческие клетки (скорее всего, фибробласты). Затем мы будем индуцировать в них экспрессию этого гена на протяжении различных интервалов, и снимать профили метилирования клеток до и после активации Oct4.

Этапы:
1. Конструирование вектора с геном Oct4 под контролем Tet-On системы. Срок: 3 месяца.
2. Культивирование и трансформация клеток. Срок: 2 месяца.
3. Индукция Oct4 и снятие профилей метилирования клеток. Срок: 2 месяца.

Бюджет: По нашим расчетам бюджет данного эксперимента составит 15 000 долл США.
Видео обзоры нашего подхода
Если вам интересно узнать больше об эпигенетическом омоложении как о подходе к борьбе со старением, предлагаем вашему вниманию следующие видео:
Видео презентация о генной терапии омоложения
(5 минут)

Простыми словами об эпигенетическом омоложении
(6 минут)
Описание эксперимента с Oct4 (5 минут):
Новости по эксперименту:
Как некоторые уже знают, мы скооперировались с Gabriel Licina и его командой для проведения этого эксперимента. Недавно мы финализировали дизайн нашего комбинированного вектора, несущего ген rtTA и ген Oct4 в системе Tet-On и отправили его на сборку. Вот наш финальный дизайн:

Как только векторная сборка будет завершена, мы проверим, что вектор работает, трансфицируя им человеческие дермальные фибробласты и измеряя уровни экспрессии Oct4 в них с и без Dox.

После этого мы проведем основные экспериментальные процедуры дифференциальной индукции Dox в человеческих дермальных фибробластах (от донора в возрасте 40-50 лет), трансфицированных нашим вектором, соберём полученные клетки и отправим их в Zymo для анализа часов метилирования.

Наш предполагаемый протокол дозирования выглядит следующим образом: индуцировать экспрессию Oct4 в трансфицированных фибробластах в течение 1,2,3 или 5 дней подряд с помощью Dox. В последний день каждого цикла индукции мы будем собирать часть культуры, которую затем отправим для секвенирования. Оставшуюся часть культуры будем использовать для экспериментов по расслаблению/вымыванию, чтобы установить, возвращается ли метилирование на исходные значения: то есть будем собирать клетки для анализа часов метилирования через 2,6,12 дня после снятия прекращения индукции Oct4 с помощью Dox.

Продолжение следует!
Как помочь с краудфандингом:
Мы благодарны любой сумме! Пожертвовать средства на эксперименты можно одним из следующих способов:

BTC: 1JKgqMpHfo7iA2DwJo787U2GRuRkkzp8Vg
ETH: 0x56e0e27b16Ba5Bf2d64D9f1DD27b0023231F275F
Paypal: ydeigin@gmail.com
Сбербанк: 5469380067411503
Яндекс.Деньги: 410014484258634
WebMoney: Z377288589569 R616204925788

Спасибо!
Контакты
E-mail: info@youthereum.io


Наша группа в Фейсбуке: